實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶的具體操作方法
臺(tái)式離心機(jī)TD5A-WS可以應(yīng)用于乳酸脫氫酶及輔酶的提取。乳酸脫氫酶，是一種不需氧脫氫酶，以輔酶I(NAD﹢)為輔酶，催化乳酸與丙酮酸的可逆的氧化還原反應(yīng)。肌肉中含有大量的乳酸脫氫酶，在乳酸含量較高及氧氣充足情況下，催化乳酸生成丙酮酸，體外實(shí)驗(yàn)中，為觀察方便，在隔絕空氣后以甲烯藍(lán)作為受氫體，井用固定反應(yīng)中生成的丙酮酸，而使乳酸全部轉(zhuǎn)化為丙酮酸。今天我們對(duì)如何通過(guò)臺(tái)式離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶I進(jìn)行介紹。
通過(guò)離心提取乳酸脫氫酶及輔酶用到的材料、試劑及設(shè)備有：(1)動(dòng)物后腿肌肉;(2)9g/LNaCl溶液;(3)活性炭;(4)10g/L乳酸鋰溶液;(5)5g/LKCN溶液;(6)乳缽;(7)臺(tái)式離心機(jī)TD5A-WS等
具體操作方法：
1.輔酶I(NAD﹢)的制備：取動(dòng)物后腿肌肉2g置沸水浴中煮沸4—5分鐘(抑制酶的活力，防止將輔酶I破壞)，取出冷卻、剪碎，加入少許9g/LNaCl溶液及細(xì)沙用乳缽研磨成糊狀，再加9g/LNaCl溶液8ml混勻，利用臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行離心沉淀，收集上清液，儲(chǔ)冰箱備用。
2.乳酸脫氫酶酶蛋白的提?。喝?dòng)物后腿肌肉2g置乳缽中，加入少許9g/LNaCl溶液及細(xì)砂，仔細(xì)研磨后再加9g/LNaCl溶液8ml混勻，用雙層紗布過(guò)濾，濾液加活性炭0.5g振搖數(shù)分鐘后放置半小時(shí)，并時(shí)常搖動(dòng)，然后通過(guò)臺(tái)式離心機(jī)離心分離，取上清液備用。
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